1、什么是细胞培养？

细胞培养是指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。

（1）原代培养

原代培养是指细胞从组织中分离出来后，在适宜条件下增殖，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。

（2）细胞系

第一次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。来自于原代培养的细胞系寿命有限，随着细胞的传代，生长能力最强的细胞会占据优势，最终导致细胞群体在基因型和表型上达到一定程度的均一性。

（3）细胞株

如果通过克隆或其他方法从培养物中阳性筛选出了细胞系的亚群，则该细胞系成为一个细胞株。与亲代细胞系起始时相比，细胞株通常会获得一些其他的遗传学改变。

2、细胞培养的应用

细胞培养是细胞生物学和分子生物学所使用的一项重要技术，为细胞正常生理和生化研究（如代谢研究、衰老研究）、药物和毒性化合物对细胞的作用、以及致突变性和致癌性研究提供了上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发，以及生物化合物（如疫苗、治疗性蛋白质）的大规模生产。

在这些应用中，使用细胞培养的一大优势在于，使用来源于同一克隆的一批细胞可获得稳定一致、可重复的结果。

3、细胞的形态

根据细胞的形状和外观（即形态），可将其分为三大类。

（1）成纤维（或成纤维细胞样）细胞是双极或多极细胞，呈细长的形状，并附着在基质上生长。

（2）上皮样细胞呈多边形，尺寸更规则，并附着在基质上分呈散在斑片状生长。

（3）淋巴母细胞样细胞呈球形，通常悬浮而不附着于表面生长。

4、细胞培养的方式

（1）贴壁培养

贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞。此类需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质（玻璃或塑料等无活性物质）的表面生长、生存和维持，并终在附着面生长至单层，铺满平面时便会发生接触抑制。

（2）悬浮培养

来源于血液、淋巴组织的细胞，及许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞等属于悬浮培养型细胞，细胞为非贴壁依赖性细胞，无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。

5、常用的细胞类型举例

（1）293细胞

很常用的表达研究外源基因的细胞株。细胞总体上分为293T和293F两种类型，293T贴壁培养，293F悬浮培养。

来源：人体肾脏

形态：上皮细胞

注释：该细胞含腺病毒5DNA

培养液：MEM，10%FBS

传代：吸去培养液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次）

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

（2）CHO-K1

细胞实验中常用细胞株，在生物制药中使用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。

来源：Cricetulusgriseus(中国仓鼠)卵巢

形态：表皮细胞

注释：CHO-K1由CHO衍生而来，CHO是T.T.Puck在1957年从一只成年中国仓鼠卵巢获得的。

培养液：F-12，10%FBS

传代：吸去培养液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：4到1：8为宜，传代期间培养液更换1-2次）

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

（3）Vero细胞

Vero细胞成功用来培养狂犬病疫苗、乙脑疫苗等多种疫苗，在非典期间又为研究冠状病毒做出贡献，在医药研究种广泛应用。

来源：非洲绿猴肾细胞

形态：上皮细胞

注释：该细胞是日本千叶大学的Y.Yasumura和Y.Kawakita于1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的。

培养液：MEM，10%FBS

传代：吸去培养液。用0.25%(w/v)Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：3至1：6为宜，传代期间培养液每周更换2-3次）

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮

（4）Hela细胞

Hela细胞是在所有细胞株中最著名的。它来源于美国的HelenLane，1951年死于子宫颈癌。但源自她的肿瘤的细胞却在世界各地的实验室中得到广泛的使用。

来源：人宫颈癌 

形态：上皮细胞 

注释：Hela细胞显角蛋白免疫沉淀染色阳性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB和p53的低水平表达。

培养液：MEM，10%FBS

传代：吸去培养液。用0.25%（w/v）Trypsin-0.53mMEDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶活性）。加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：6为宜，每周传代2-3次）

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

（5）Sf9细胞

Sf9细胞常在Baculovirus（杆状病毒）表达系统中用作宿主细胞，来表达外源蛋白。

来源：叙利亚仓鼠肾细胞

形态：纤维原细胞

生长特性：贴壁/悬浮

注释：这个细胞来自于一只出生一天的新生仓鼠，随后被改造成一个易于作表达的宿主细胞株。

培养液：TNM-FH，10%FBS

传代：每隔一天用新鲜的培养基将其稀释到新的培养瓶中继续培养。

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

（6）HepG2细胞

HepG2细胞来源于一个15岁白人的肝癌组织。该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。该细胞能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应。

来源：人肝癌细胞

形态：上皮细胞

生长特性：贴壁

注释：该细胞表达3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。该细胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的环境下过氧化氢酶mRNA表达增加，ApoA-ImRNA表达减少。

培养液：MEM，10%FBS。

冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

6、细胞培养的环境

细胞培养基是培养环境中最重要的组成部分，因为它为细胞生长提供了必要的营养、生长因子和激素，并调节培养物的pH值和渗透压。

（1）基础培养基

大多数细胞系在含有氨基酸、维生素、无机盐和碳源（例如葡萄糖）的基础培养基中生长良好，但在这些基础培养基的配方中必须进一步添加血清。

（2）减血清培养基

在细胞培养实验中，减少血清不良影响的另一种策略是使用减血清培养基。减血清培养基是富含营养物质和动物源性因子的基础培养基配方，可减少所需的血清量。

（3）无（免）血清培养基

无血清培养基（SFM）通过用适当的营养和激素配方替代血清，避免了使用动物血清的问题。无血清培养基配方适用于许多原代培养物和细胞系，包括用于生产重组蛋白的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系、各种杂交瘤细胞系、昆虫细胞系Sf9和Sf21（草地贪夜蛾）以及用作病毒生产宿主的细胞系（例如293、VERO、MDCK、MDBK等）。使用无血清培养基的主要优势之一是，能够通过选择生长因子的适当组合使培养基对特定细胞类型具有选择性。

7、细胞培养基的各成分以及理化性质

细胞培养基必须含有充分的营养物质，才能满足新细胞合成、细胞代谢等生化反应所需要的物质和能量。细胞培养基的主要成份是水、氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助营养物质等。此外，还可能含有血清、血清替代成分、pH指示剂等。
（1）水

水是细胞的主要成分，也是细胞赖以生存的主要环境。细胞培养液中90%以上的成份是水。细胞对水的品质非常敏感，水的品质将直接影响细胞培养的效果。而水中通常含有重金属、氯、磷、有机物、热原等污染物，细胞培养用水须经过纯化，品质应符合中国药典注射用水标准或者超纯水的标准。

（2）能源和碳源

能源和碳源是用于维持细胞生命和支持细胞生长，主要包括糖、糖酵解的产物和谷氨酰胺，其他氨基酸是次要的能源和碳源物质。细胞能够利用的糖类主要是六碳糖，目前大多体外培养时选取葡萄糖作为细胞的主要碳源和能量来源，因此细胞培养基中基本都含有葡萄糖，含量一般为5～25mmol/L。

在葡萄糖浓度较高时，细胞主要通过扩散作用吸收葡萄糖，细胞膜内外的葡萄糖浓度梯度是细胞吸收葡萄糖的动力；在葡萄糖浓度较低时，主要由钠离子推动的高亲和性转运过程使细胞摄取葡萄糖。葡萄糖进入细胞后参与糖酵解、核酸代谢、糖原合成、能量代谢以及一些氨基酸的合成。与体内的能量供应途径不同，体外培养时，一定的浓度范围条件下，葡萄糖主要经糖酵解循环转化成乳酸来为细胞提供能量。

（3）氮源（氨基酸）

氨基酸在细胞内的重要生理作用主要体现在以下几个方面：

①是蛋白质的基本组成单位，用于合成蛋白质和多肽；

②可用于合成某些具有重要生理作用的含氮化合物，如核酸、尼克酰胺等；

③某些氨基酸还具有独特的生理作用，如甘氨酸参与生物转化作用，丙氨酸和谷氨酰胺参与细胞内氨的运输等；

④可转变成糖类和脂肪，参与氧化供能。

绝大部分细胞对谷氨酰胺有较高的要求，可能因其不仅是细胞的主要氮源，且可作为细胞生长的能源物质和嘌呤、嘧啶核苷酸的前体，另外还可直接作为细胞增殖和产物合成中的蛋白质和多肽的组成成分。在缺少谷氨酰胺时，细胞会生长不良，甚至死亡。由于谷氨酰胺具有多种生理作用，体外动物细胞培养时需要大量谷氨酰胺，利用量常超过其他必须氨基酸利用量的总和。

（4）维生素

维生素是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。维生素可分为水溶性和脂溶性两类，水溶性维生素主要包括泛酸、维生素B12、叶酸、烟酰胺、吡哆醛、硫胺素、核黄素、维生素C、胆碱、肌醇等；脂溶性维生素主要包括维生素A、D、E、K等；有的培养液中还直接采用ATP和辅酶A；大部分培养基中还有生物素。

许多维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，没有它们，酶便没有活性，代谢活动将无法进行。比如，泛酸可以在细胞内转变成酰基载体蛋白和辅酶（如辅酶A），参与糖类、脂类和蛋白质代谢中的催化反应；维生素B12则在细胞内参与叶酸的合成和脂肪酸的合成等。不同配方的细胞培养基中维生素的浓度有较大差异。

（5）无机盐

无机盐是细胞维持生命活动所不可缺少的营养成分，主要有Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl－、PO43-、SO42-、HCO3－等，主要作用为维持细胞培养液渗透压平衡，参与细胞的代谢活动。此外，通过提供钠，K+和Ca2+，帮助细胞调节细胞膜功能。Na+是细胞外液中最主要的阳离子，对维持渗透压的恒定有决定性的作用，还与Cl－共同参与生物电活动、维持水平衡和酸碱平衡等。K+主要分布在细胞内液，对于激活某些酶是必需的，并在调节细胞内环境的酸碱平衡上也有极重要意义。Ca2+和Mg2+主要参与信号传导、能量代谢、脂肪酸合成、核糖体稳定和蛋白质合成等多种生理作用。PO43－、SO42－、HCO3－是基质所需阴离子，同时是细胞内电荷的调节者。磷对于细胞的生长、代谢和调控都有重要的作用，含磷的化合物如核酸、磷脂、蛋白质是构成细胞的主要成分，ATP、ADP是能量生成、存储和利用的不可或缺的化合物。

此外，微量元素如铁、钴、镍、硒、碘、铜、锌、锰、铬、钼、氟等对于细胞生长代谢和产物合成都有促进作用。

（6）其他添加成分

在低血清、无血清细胞培养基中，为满足细胞生长增殖需要，常常添加一些成份：蛋白质、多肽、核苷、嘌呤、柠檬酸循环的中间产物、脂类、及一些血清替代因子等。其中蛋白质具有重要的作用，动物细胞对许多物质（难溶于水的离子或脂类物质）的摄取需要借助蛋白质的传递作用，如白蛋白、传递蛋白、贴壁蛋白等能够携带脂肪酸、激素、矿物质等促进细胞生长。转铁蛋白是一种重要的传递蛋白，能够结合铁，促进细胞对铁离子的吸收，并具有解毒作用，其促生长作用可能与其具有生长因子的功能有关。胰岛素可促进细胞对葡萄糖和氨基酸的利用，商业化中一些生长因子以重组蛋白形式添加到培养基中，主要用来刺激细胞增殖，并可促进糖元和脂肪酸的合成。乙醇胺是一种重要的刺激细胞生长的化合物，是脑磷酸的合成前提。

（7）保护剂

细胞保护剂是保护细胞免受渗透压变化、剪切力、氧化及气泡作用等引起的损伤的物质。在使用生物反应器培养动物细胞时，细胞易被机械搅拌和通气鼓泡产生的流体剪切力和气泡作用所伤害甚至破损死亡。为降低这种损伤，除优化生物反应器结构和生产工艺外，可在细胞培养液中添加一些保护剂。其主要是通过改变细胞培养基物性或是对细胞具有保护作用的物质，常用的种类有血清、白蛋白、聚乙二醇（PEG）、非离子性表面活性剂PluronicF68或是其他一些高分子聚合物等。

（8）pH值

动物细胞大多数需要轻微的碱性条件，适宜pH在7.2～7.4之间。细胞培养基的pH值通常需经校正的pH计来测定。在细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，二氧化碳不断被释放，培养液变酸，pH值发生变化。酚红是细胞培养基中最常用的pH指示剂，但依靠细胞培养基中的酚红等pH指示剂进行判断，需要实验员的经验积累，存在较大的主观性。实际上，个性化细胞培养基或是无血清细胞培养基中酚红含量较少或是不含酚红，只能通过pH计或者pH电极进行pH值的检测，结果更为准确可靠。

（9）缓冲能力/CO2

细胞培养基应具有一定的缓冲能力。细胞培养过程中造成细胞培养液pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2。在封闭式培养过程中CO2与水结合产生碳酸，细胞培养液pH很快下降；打开培养器具时CO2逸出则会引起pH升高。细胞培养基通常采用NaHCO3-CO2缓冲系统，按下列化学反应方程式调节细胞培养基的pH值：
H2O+CO2 →H2CO3 ⇌H++HCO3－
NaHCO3 ⇌Na+ +HCO3－

此外，还有缓冲能力较高的磷酸盐缓冲系统。但碳酸盐缓冲系统的细胞毒性小、成本低，在细胞培养中应用得更为广泛。另一种较为常用的缓冲液是HEPES（羟乙基哌嗪乙硫磺酸）液，它是一种非离子两性缓冲液，在pH7.0~7.2范围内具有较好的缓冲能力。高浓度的HEPES可能对细胞有毒性作用，细胞培养时HEPES的添加浓度一般为10～25mmol/L。

（10）温度

温度对细胞培养基有较大的影响，温度过高可引起营养成份的降解或破坏，细胞培养基的pH、离子强度和电解常数pKa也可能受到影响。如细胞培养液中的谷氨酰胺，在高温条件下降解的速度较快，如35℃贮存时，放置3天降解25%左右，在4℃贮存3周降解约20%。

（11）粘滞性及表面张力

含血清细胞培养液的粘滞性主要是由血清引起的，在转瓶培养贴壁细胞时，培养液的粘滞性对细胞生长没有多大影响；但在生物反应器悬浮培养细胞时，细胞培养液的粘滞性则直接影响搅拌转速控制及搅拌剪切力对细胞造成的损伤程度。

表面张力对细胞培养有较大的作用，尤其在利用生物反应器进行悬浮培养时，搅拌和通气都会引起泡沫的产生。对于含血清培养液，由于血清中多种蛋白的存在，搅拌时产生的气泡较多，气泡的上升运动对细胞的损伤程度还有争议，但气泡的破裂对细胞有明显的损伤作用。为降低这种损伤，可通过在细胞培养基中添加一些保护剂，降低细胞-气体和细胞-液体的表面张力，减少气泡的形成。

（12）不同细胞培养基的除菌方式及注意事项

细胞培养基灭菌的方式分为高压灭菌和膜过滤除菌，不同的培养基由于其营养成份不同，灭菌方式也可能不同。

①高压灭菌
某些培养基（如MEM）可进行高压灭菌，这类培养基一般不含有L-谷氨酰胺和碳酸氢钠，一般是在培养基高压灭菌后才加入。另外可用耐高压的谷氨酸盐（如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）代替L-谷氨酰胺。可高压灭菌的培养基在121℃、15psi，15分钟的条件下完全可达到灭菌效果及营养成分的最小损失，不需将灭菌时间延长。

②膜过滤除菌

绝大多数细胞培养基不适宜高压灭菌，因培养液中常含有维生素、蛋白质、多肽、生长因子等物质，这些物质在高温或射线照射下易发生变性或失去功能，因而上述液体多采用过滤消毒以除去细菌。可供过滤灭菌使用的滤膜很多，其材料多为polyethersulphone（PES）、尼龙、多聚碳酸盐、醋酸纤维素、硝酸纤维素、PTFE、陶瓷等。膜过滤除菌是当前较为常用及便捷的一种方法，常采用0.2μm孔径的滤膜，部分采用0.1μm孔径。与高压过滤方式相比，滤膜具有使用期限且价格较高，但对细胞培养基的营养成份破坏性较小。

8、细胞培养基中重要的几种添加成份

（1）D-葡萄糖（D-Glucose）

作用：细胞生长所需的主要能量来源。

①最初的DMEM中，葡萄糖浓度为1g/L，现在称其为低糖型DMEM，适合培养代谢作用较慢、依赖性贴壁细胞的哺乳动物细胞。

②高糖型DMEM中的葡萄糖浓度为4.5g/L，普遍应用于生长快、粘附性低的细胞、杂交瘤的骨髓瘤细胞、克隆细胞、DNA转染的转化细胞、原代病毒宿主细胞、单一细胞的培养以及疫苗的生产，例如利用CHO细胞表达EPO和生产乙肝疫苗。

③使用无糖培养基的主要目的是，通过控制细胞的能量来源，研究细胞的代谢过程或葡萄糖利用效率。

（2）L-谷氨酰胺（L-glutamine）

作用：L-谷氨酰胺是一种氨基酸，细胞的重要能量来源，参与蛋白质的合成，也为合成核酸提供碳源。

存在的问题：

①L-谷氨酰胺不稳定，在中性的水溶液中会自发降解。

②降解产物氨对细胞有毒性。

③对氨敏感的细胞（如干细胞和原代细胞等）或培养环境（高密度反应器，无补料的长期培养）不推荐含L-谷氨酰胺的培养基。

解决方案：

①选择不含谷氨酰胺的培养基，使用前自行添加L-谷氨酰胺。

②谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%，使用中最好单独配制，置-20℃冰箱中保存，使用前加入细胞培养液中。

（3）丙酮酸钠（Sodiumpyruvate）

作用：能量来源

①丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。

②葡萄糖不足的时候，细胞可以代谢丙酮酸钠。

③保证细胞更好地生长。

④非必需组分。

（4）HEPES

作用：pH缓冲剂。

①是一种氢离子缓冲剂，其作用不依赖于二氧化碳。

②在一定范围内对细胞无毒性作用，能较长时间控制恒定的pH范围，保证细胞良好生长。

③部分细胞对酸碱度的变化非常敏感，建议使用含有HEPES的培养基。

④添加后价格相对较高，非必需。

（5）酚红（Phenolred）

作用：pH值指示剂，pH值低时培养基呈黄色，pH值高时培养基呈紫色，pH值7.2～7.4时为红色，最适合细胞培养。

①在一些无血清培养基的配方中酚红会干扰钠-钾平衡培养，干细胞或细胞克隆时倾向于不加酚红。

②酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），在培养雌激素敏感的细胞（如乳腺组织）时，建议使用不含酚红的培养基。

③酚红的颜色会对流式细胞分析产生一定的干扰，不建议使用含酚红的培养基制备细胞样品。

（6）碳酸氢钠（Sodiumbicarbonate）

作用：pH缓冲剂。

①pH6.8-7.8为细胞生长的最佳pH条件，多数培养基利用碳酸氢钠进行缓冲。

②碳酸氢钠的缓冲需要二氧化碳。高碳酸氢钠(1.5-3.7g/L)需要5-10%二氧化碳；低碳酸氢钠(0.35g/L)不需要二氧化碳培养箱。

③干粉培养基需要在配制时单独添加碳酸氢钠。