细胞转染实验技术——功能实验的第一步
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发布时间:2022.02.10 新闻来源:品科研-生物试剂,化学试剂,科学服务试剂超市-河北品科研生物科技有限公司官网 浏览次数:1474 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
转染(transfection)是真核细胞主动或被动导入外源核酸片段(DNA或RNA)而获得新的表型的过程。转染后的细胞会产生重组蛋白,或者特异性的增强/抑制细胞中的基因表达。转染后的检测主要包括基因水平和蛋白水平的检测。一定时间后收集转染处理后的细胞,采用超声或酶解的方法破碎细胞,离心得到上清。针对基因水平,使用普通 PCR 或 RT-PCR 进行验证,蛋白水平,使用 western blot 检测,简单,快速,准确。
转染的类型 根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短,可以分为瞬转和稳转。根据转染方式可以分为化学方法,生物方法,物理方法。
瞬时转染是指将构建好的质粒或者siRNA通过某种方式导入到哺乳动物细胞内(常用的工具细胞 HEK293 细胞),该外源核酸片段不整合到细胞自身的基因组上。随着细胞的生长分裂,外源基因会逐渐丢失,在细胞内能够存在 3-4 天,无法随着细胞的分裂进入到子代细胞中。在这一段时间内,外源基因在细胞内发生转录翻译,得到少量的蛋白。根据使用的载体不同,收集目的基因/蛋白进行检测的时间不同,通常在转染后48h,目的蛋白的表达水平最高。瞬时转染的特点是短时间内进行蛋白的小量制备,满足后续的实验要求。
稳定转染是外源DNA整合到细胞基因组中,成为细胞基因组的一部分从而得以复制,随着细胞分裂,子代细胞也同样表达外源基因,这就是稳定转染细胞的标志。稳定转染是建立在瞬时转染的基础上的,先对细胞进行转染,再对得到的细胞池进行筛选,筛选标记是抗生素,荧光报告基团等,通常需要2-3周的筛选时间,由此形成稳定转染的细胞系。稳定转染的特点是能够得到蛋白的大量、长期生产,满足后续的一系列体内体外的表型实验。
转染方式
考虑到转染效率是影响细胞实验的重要因素,因此选择合适的转染试剂和转染方式很关键。下面我们介绍一下常见的转染方式。
细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成,对于也带负电荷的核酸片段(DNA和RNA)来说是不可透过的屏障,因此研究人员开发了很多方法能使核酸穿透细胞膜进入胞内,大致分为三类:
转染的影响因素:
转染过程中许多因素会影响转染效率:如细胞类型;细胞密度;质粒大小、质粒纯度;血清;转染试剂等。
转染实验中,以下几个因素进行调整和优化:
1. 转染前的细胞状态和密度
转染时细胞密度以 50-80%最佳,细胞密度过高会严重影响细胞状态和转染效率(周期进程阻滞,凋亡增加等)。同时支原体污染会严重降低细胞的转染效率,因此转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。
2. 转染时的质粒纯度
如果提取的质粒不纯,如带少量盐离子,蛋白、代谢物污染等都会显著影响转染复合物的有效形成;而含有内毒素的质粒对细胞存在很大的毒性作用(一般用去内毒素的提取试剂盒)。抗生素一般对真核细胞无毒,但转染过程中细胞通透性增加,会使抗生素进入细胞,从而降低细胞活性,导致转染效率降低。
3. 转染后的筛选时间
转染后筛选不能太早或太晚,因为转染了外源基因的细胞代谢负荷大,增殖较慢,太晚会被没有外源基因转入的细胞所淹没,最终导致筛选不出阳性克隆。一般要在转染后48h之后开始加抗生素筛选。
4. DNA 与转染试剂的比例 许多转染方法需要优化 DNA 与转染试剂的比例。不同细胞系转染效率通常不同,不同转染试剂转染效率差别很大,通常需要根据转染试剂说明书进行预实验,选择合适浓度的外源DNA或RNA,调整外源核酸片段和转染试剂的比例。 相关产品推荐:
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