不同来源酵母浸粉对大肠杆菌生长性能的影响
一、实验背景与目的
LB培养基是微生物学实验中最常用的基础培养基，酵母粉作为核心氮源组分，直接影响细菌的生长速率和最终菌体密度。本次实验通过筛选大肠杆菌在LB培养基中的生产情况，从而确定不同来源酵母浸粉的适用程度。实验对比了三个酵母粉品牌：LB-Ref（JSENB进口,货号JS0685） 、LB-1（X厂家） 和LB-2（摩莱国产，货号MG58042） 。胰蛋白胨统一选用JSENB(货号JS0688)原料，氯化钠统一选用JSENB（货号JS0492）原料，以排除其他变量干扰。
二、实验设计
2.1液体LB摇瓶培养初筛（OD600生长曲线测定）
2.1.1 材料与试剂
- 待筛选LB液体配方（LB-1 X厂家酵母浸粉、LB-2摩莱酵母浸粉）、对照LB-Ref（JSENB进口）酵母浸粉。
- 待活化的目标菌株（大肠杆菌）
- 无菌娃哈哈、无菌枪头、锥形瓶、比色皿
- 分光光度计/酶标仪（波长600 nm）、恒温摇床、超净台
2.1.2 培养基配制
- 按配方配制各LB培养基，每组LB及LB-Ref各配制1瓶（每瓶300 mL，压前调PH至7.2，高压后各分装4瓶，50ml/瓶，其中一瓶做空白，便于接种和取样）。合计共配制3个配方，分装12瓶液。
2.1.3 菌株活化，菌株 → 活化（菌种无需解冻直接挑取一小块即可）
- 从冰箱取出菌株，接种至10 mL LB-Ref液体培养基，37℃、200 rpm振荡培养。
- 取菌块一块小块→10 mL 液体LB 里（JSENB,货号JS0685）标记①
- 取菌块一块小块（略小）→10 mL 液体LB 里（JSENB,货号JS0685）标记②
- 37℃，200 rpm 摇床 过夜 12～16 h（空白培养基一起培养，作0标使用）
→ 选OD值为0.6-1.5的菌液作为种子液（0.6-,0.1对数中期，效果最佳）
| 样品 | ① | ② |
| OD值（过夜培养后） | 1.797 | 1.784 |
| 选取序号②进行2:7稀释后作为种子液，OD值0.904 | ||
2.1.4 接种与培养
- 种子液稀释
如种子液OD值偏高可用无菌LB-Ref将活化后的种子液稀释至OD₆₀₀≈0.6-0.1，作为统一接种源。
- 接种操作
向各LB及LB-Ref的培养瓶中，按1%（v/v）比例接种稀释后的种子液（如50 mL培养基接种0.5 mL种子液）。
空白对照不接种。
- 培养条件
所有样品与空白均置于37℃、200 rpm摇床中培养，记录起始时间（0 h）。
2.1.5 OD值测定（关键步骤）
- 仪器准备
开启分光光度计/酶标仪，预热15–30 min，设置检测波长为600 nm。
用75%酒精擦拭比色皿，确保无指纹、污渍或气泡。
- 起始OD（0 h）测定
· 取各LB及LB-Ref的空白对照液体，加入比色皿（体积2mL，与样品一致）。
· 将空白对照放入仪器，点击“调零/Blank”，将该LB的空白OD校准为0.000。
· 取出空白，放入对应LB的样品液（0 h取样），读取OD值，记为OD₀。
· 计算起始OD净值：OD₀净 = OD₀ - 空白OD。
· 重复步骤2–4，完成所有LB及LB-Ref的起始OD测定。
· 时间点OD测定
- 按实验设计，在培养过程中选取关键时间点（如2 h、4 h、6 h），重复上述步骤：
· 用对应LB的空白调零。
· 测定样品OD值，记录为ODₜ。
· 计算ODₜ净 = OD - 空白OD。
- 绘制简易生长曲线：以时间为横轴，OD净值为纵轴，观察生长趋势。
- 终点OD测定
· 选取培养终点（如12 h或24 h），按上述方法测定所有样品的OD值，计算终点OD净值，作为核心筛选指标。
2.1.6 观察记录项
每种LB在配好后、灭菌后、培养终点三个节点均拍照记录：颜色深浅、有无沉淀/絮状物、是否起泡/挂壁、空白OD本底值。
2.2固体LB平板复筛验证
2.2.1 材料与试剂
- 待筛选LB固体配方（LB-1X厂家、LB-2摩莱）、对照LB-Ref（JSENB进口）酵母浸粉。
- 待活化的目标菌株（大肠杆菌）
- 无菌娃哈哈、无菌枪头、锥形瓶、比色皿、一次性无菌平板
- 分光光度计/酶标仪（波长600 nm）、恒温摇床、超净台、恒温培养箱
2.2.2 培养基配制
- 配制LB-Ref液体培养基用于菌种活化，配制量125ml。培养基原始PH6.76，调PH至7.2后，121℃灭菌20min。
-按配方配制各LB固体培养基，LB及LB-Ref各配制1瓶（每瓶300 mL，压前调PH至7.2，高压后50-60℃倾倒平板，每种15个平板备用。
2.2.3 菌株活化，菌株 → 活化（菌种无需解冻直接挑取一小块即可）
- 从冰箱取出菌株，接种至10 mL LB-Ref液体培养基（菌块直径约4mm），37℃、200 rpm振荡培养。 过夜 12～16 h（空白培养基一起培养，作0标使用）
→ 选OD值为0.6-1.5的菌液作为种子液（0.6-,0.1对数中期，效果最佳）
| 样品 | ① |
| OD值（过夜培养后） | ＞1.0 |
| 1:3稀释后＞0.9，按1:9稀释后培养2h测OD值1.206 | |
2.2.4 平板涂布与培养
- 菌液稀释
用0.9%生理盐水将待测大肠杆菌菌液进行梯度稀释，得到10-5、 10-6 、 10-7 、 10-8稀释体系。
- 涂布操作
分别吸取各梯度菌液100μL均匀涂布至LB固体平板，每一稀释梯度设置3组平行。
设置空白对照组，吸取100 μL无菌生理盐水涂布平板，其余培养条件与样品组保持一致，验证稀释体系与操作过程是否存在杂菌污染。
- 培养条件
所有样品与空白均置于37 ℃恒温培养箱倒置培养48小时。
三、结果与分析
3.1培养基外观与PH对比
| 分组 | 配方 | LB-Ref | LB-1 | LB-2 |
| 蛋白胨 | 10g | 4 | 4 | 4 |
| 酵母粉 | 5g | 2 | 2 | 2 |
| 氯化钠 | 10g | 4 | 4 | 4 |
| 配制量 | 1L | 400ml | 400ml | 400ml |
| 空白外观压前 | 黄，透亮 | 色深，略有杂质 | 黄，透亮，略浅 | |
| 空白外观压后 | 透亮，色变深 | 透亮色深 | 透亮色变深 | |
| 空白培养结束 | 透亮 | 透亮色深 | 透亮 | |
| PH(溶后)25℃ | 6.30 | 5.74 | 6.06 | |
| 高压分装 | 压前PH调至7.2 121℃20min | |||
| PH(灭后)25℃ | 7.02 | 7.03 | 7.03 | |
| PH变化值 | 0.02 | 0.03 | 0.03 | |
| 空白OD培养前 | O标 | 0.037 | -0.014 | |
压前、压后图片对照
外观对比分析：
摩莱酵母浸粉在配制后即呈现黄色透亮、色泽纯净的外观，与JSENB对照品质相当。相比之下，X厂家酵母浸粉配制时颜色偏深、略有杂质，表明其原料纯度或加工工艺不及摩莱。
三组pH经高压灭菌后均稳定在7.02-7.03，但摩莱国产在溶后pH（6.06）上更接近中性，更有利于维持培养基的初始缓冲状态。
3.2 液体培养大肠杆菌生长曲线对比
| 培养基 | 起始OD | 2.5小时 | 4.5小时 | 6小时 | 培养终点,隔夜 |
| LB-1-1 | 0标 | 0标 | 0标 | 0标 | 0标 |
| LB-1-2 | 0.009 | 0.226 | 0.825 | 1.219 | 1.926 |
| LB-1-3 | 0.008 | 0.238 | 0.849 | 1.228 | 1.926 |
| LB-1-4 | 0.013 | 0.260 | 0.890 | 1.204 | 1.889 |
| 平均值 | 0.010 | 0.241 | 0.855 | 1.217 | 1.914 |
| SD | 0.003 | 0.017 | 0.033 | 0.012 | 0.021 |
| RSD | 26.5% | 7.1% | 3.8% | 1.0% | 1.1% |
| LB-2-1 | 0标 | 0标 | 0标 | 0标 | 0标 |
| LB-2-2 | 0.013 | 0.204 | 0.848 | 1.171 | 1.869 |
| LB-2-3 | 0.014 | 0.227 | 0.893 | 1.205 | 1.841 |
| LB-2-4 | 0.012 | 0.226 | 0.887 | 1.180 | 1.846 |
| 平均值 | 0.013 | 0.219 | 0.876 | 1.185 | 1.852 |
| SD | 0.001 | 0.013 | 0.024 | 0.018 | 0.015 |
| RSD | 7.7% | 5.9% | 2.8% | 1.5% | 0.8% |
| LB-Ref-1 | 0标 | 0标 | 0标 | 0标 | 0标 |
| LB-Ref-2 | 0.010 | 0.150 | 0.731 | 1.213 | 1.686 |
| LB-Ref-3 | 0.008 | 0.174 | 0.759 | 1.242 | 1.690 |
| LB-Ref-4 | 0.009 | 0.191 | 0.847 | 1.250 | 1.681 |
| 平均值 | 0.009 | 0.172 | 0.779 | 1.235 | 1.686 |
| SD | 0.001 | 0.021 | 0.061 | 0.019 | 0.005 |
| RSD | 11.1% | 12.0% | 7.8% | 1.6% | 0.3% |
各组大肠杆菌振荡培养过程中，分别在0 h、2.5 h、4.5 h、6 h、22 h取样，测定菌液OD600，以OD600表征菌体浓度，每组平行取平均值，绘制大肠杆菌生长曲线。结果表明LB-1、LB-2两组菌体浓度均优于LB-Ref对照组；培养终点LB-1菌体浊度更高，LB-2对数阶段增殖平稳，生长趋势均衡。
3.3不同培养节点菌体状态拍照记录（液体培养）
3.4固体平板菌落生长对比
有效计数梯度为10-5
| 酵母浸粉组别 | 平行平板1菌落数 | 平行平板2菌落数 | 平行平板3菌落数 | 平均值 |
| LB-Ref | 78 | 257 | 188 | 174 |
| LB-2 | 110 | 356（剔除） | 126 | 118 |
剔除LB‑2超标平板数据，结果显示LB‑Ref菌落数量更高；两种培养基均可培养大肠杆菌，LB‑Ref营养性能略优。
3.4综合结果比对
| 对比维度 | LB-Ref（JSENB/进口） | LB-1（X厂家） | LB-2（摩莱国产） |
| 外观纯净度 | ★★★★★ | ★★★ | ★★★★★ |
| 起步速度（2.5h） | 0.172 | 0.241 | 0.219（比JSENB/进口+27%） |
| 对数中期（4.5h） | 0.779 | 0.855 | 0.876（比JSENB/进口+12.5%） |
| 终点菌体密度 | 1.686 | 1.914 | 1.852（比JSENB/进口+9.8%） |
| 重复性（全周期） | 终点最优 | 波动大 | 全程稳定 |
| 固体平板菌落表现 | 菌落饱满密度更高 | 淘汰未开展验证 | 菌落生产弱于LB-Ref |
| 液体摇瓶培养适配星级 | ★★★★ | ★★★ | ★★★★★ |
| 固体平板培养适配星级 | ★★★★★ | -（未测试） | ★★★★ |
结论：本次平行对照试验表明，LB-2（摩莱国产）可替代LB-Ref（JSENB/进口）开展大肠杆菌纯化、菌种复苏等基础培养；二者营养水平存在小幅差距，定量实验、高菌体产量培养需先进行小试，不建议直接替代。
